血管生成是指血管从已有的血管系统中生长出来，依赖于多种生长因子的表达，而血管内皮生长因子(Vascular Endothelial growth factor, VEGF)是促进血管通透性的关键诱导剂和中枢介质。因为VEGF₁₆₅同种异构体是血管生成和血管通透性的主要参与者，也是血管抑制治疗中探索最多的因素，许多细菌表达系统已经开发出来，以实现高产量，高质量和功能效力的VEGF₁₆₅蛋白质。成功的异源表达的共同目标通常是在成功率与速度、易用性、成本和使用广度之间取得平衡。许多工作的中心兴趣是优化生产条件，如振荡速度、介质、诱导温度、IPTG浓度，但蛋白质提取方法的优化仍然是一个主要挑战，因为生产的蛋白质百分比很高。很明显，在许多情况下，这里描述的方法非常相似，特别是在裂解缓冲液中使用超声来提取目标蛋白质。但结合不同的蛋白质提取方法并不常用。结合溶菌酶处理和裂解缓冲液(M5)超声处理可提高可溶性VEGF水平₁₆₅(图1)更有趣的是，这种方法的结果是对蛋白裂解物的重要澄清，从而促进了VEGF的纯化₁₆₅．采用亲和层析法进行一步纯化。

图1所示。在最佳条件下通过SDS-PAGE分析VEGF165的表达和纯化。VEGF165蛋白提取。Lane 1-5分别对应于M1氧化铝处理、M2溶菌酶处理、M3 PBS超声处理、M4裂解缓冲液超声处理、M5溶菌酶处理后再裂解缓冲液超声处理提取的总蛋白。指示溶菌酶和VEGF165。b可溶性VEGF165纯化。Lane 1可溶性细胞纯化前的裂解物;2车道通行;道3-12:在还原条件下从His-trap柱洗脱的馏分。c重组IB洗脱液的SDS-PAGE分析。Lane 1在纯化前重组VEGF165; lane 2–6 eluted fractions with 250 mM Imidazole. d Western blot analysis of the VEGF165 purification. Lane 1 eluate from the refolded VEGF165; lane 2 eluate from the soluble VEGF165 at 250 mM Imidazole; lane 3 eluate from the soluble VEGF165 at 350 mM; lane 4 empty pET21a vector lysate.

一般来说，描述的细菌表达程序导致大多数情况下产生不溶性包涵体，包涵体是目标蛋白的主要来源。事实上30%的蛋白质来自大肠杆菌它本身不能以可溶性形式表达，这意味着重组蛋白在细菌细胞中表达的主要限制是包涵体的低生产水平和低重折叠率，导致重组蛋白具有生物活性。使用高浓度尿素(8M)， 1% Triton X-100和β-巯基乙醇的简单程序确保了大量的可溶性和生物活性VEGF₁₆₅．增溶缓冲液还含有1毫米EDTA，以防止金属催化半胱氨酸的空气氧化。

单步纯化再生的VEGF₁₆₅采用镍亲和柱进行分析。类似于可溶性VEGF₁₆₅在250 mM咪唑层洗脱，用抗His-tag抗体检测。批量发酵过程产生约1.5 mg/L的纯化VEGF₁₆₅从上清和包涵体。

为了评价重组VEGF的功能₁₆₅我们使用HUVEC细胞进行了体外划痕实验，因为内皮细胞迁移在vegf相关的伤口愈合中非常重要。细胞在含或不含200 ng VEGF的无血清RPMI培养基中培养12 h₁₆₅．与200 ng VEGF在T12h处理的细胞比较₁₆₅;未处理的HUVEC细胞在任何生长因子刺激下都没有明显迁移到划伤部位。随着时间的推移，对图像进行了分析。

图2所示。细胞迁移对VEGF165的响应。A . A . T0 h时未处理的游离细胞面积b . T0 h时诱导细胞的间隙面积c . T12 h时未处理的细胞d . T12 h时200 ng VEGF165处理后的细胞迁移。b .直方图显示每种情况下伤口愈合的百分比。显著性差异:***表示p < 0.001

进一步表征重组VEGF的促血管生成特性₁₆₅我们进行了体外用鸡毛囊尿囊膜(CAM)测定血管生成。重组VEGF显著诱导CAM新生毛细血管和分支血管数量增加。

Awatef Taktak - BenAmar¹，Maram Morjen²，哈泽姆·本·马布鲁克²，拉尼娅Abdelmaksoud - Dammak¹，穆罕默德Guerfali¹，吉达市Fourati - Masmoudi¹，Naziha Marrakchi²，阿里Gargouri^1
1突尼斯斯法克斯生物技术中心真核生物技术实验室
²突尼斯巴斯德研究所，Venins et biomolsamuresis，突尼斯

出版

重组人血管内皮生长因子VEGF165在大肠杆菌中的表达、纯化及功能研究
Taktak-BenAmar A, Morjen M, Ben Mabrouk H, Abdelmaksoud-Dammak R, Guerfali M, Fourati-Masmoudi N, Marrakchi N, Gargouri A
安博快递2017年12月

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