为了提高免疫测定的灵敏度，已经开发了许多技术，如高亲和力抗体、利用Fab '片段铰链区域的特异性偶联、高活性酶和数字计数系统。我们在2018年发表在《免疫学方法杂志》上的文章中描述了一种称为免疫复合物转移酶免疫测定(ICT-EIA)的方法。

ICT-EIA使用两种类型的微球，在检测中，三明治免疫复合物从第一微球转移到第二微球(图1)。在典型的免疫分析中，检测抗体可能非特异性地结合到微球表面，发出背景信号，这可能会阻止更高的灵敏度。ICT-EIA是一种通过减少这种非特异性结合来提高免疫测定灵敏度的技术。

图1所示。ICT-EIA检测流程。ICT-EIA可以通过将免疫复合物转移到另一个珠上，从而减少非特异性结合在珠表面的检测抗体的数量。

本文主要有两个目的:1)通过与三明治EIA (Sand-EIA)的直接比较，明确ICT-EIA的敏感性水平;2)通过逐步分析ICT-EIA的反应步骤，揭示其高敏感性的机制。

我们开发了Sand-EIA和ICT-EIA三种细胞因子，TNF-α， TARC和IL-12/23p40。所有抗体和抗原均购自研发系统(Minneapolis, MN)。抗体Fab’片段分别以β- d -半乳糖苷酶作为检测试剂和二硝基苯-生物素- bsa (DNP-Bio-BSA)作为捕获试剂偶联。用DNP和Biotin标记的全IgG作为TNF-α测定的捕获抗体。sand - eia和ict - eia使用了相同的共轭物。

1)提高ict - eia对细胞因子的敏感性

对细胞因子进行sand - eia和ict - eia检测(图2)。检测限(LoD)定义为与背景信号(无抗原)相比，具有显著结合酶活性的最小抗原量(荧光信号)。使用t检验证实与背景有显著差异(P < 0.05)。Sand-EIA/ICT-EIA检测TNF-α、TARC和IL-12/23p40的LODs分别为3/0.03、1/0.01和3/0.03 pg/mL。当使用相同的缓冲液、抗体偶联物和聚苯乙烯珠时，ict - eia的灵敏度比sand - eia高100倍。

2) ICT-EIA提高敏感性的机制

图2所示。细胞因子的剂量反应曲线。ict - eia的灵敏度比sand - eia高100倍。

为了揭示ICT-EIA中信号传递的机制，在第1个珠上捕获检测偶联物，在第1个珠上洗脱后，测量酶活性^圣头，和后捕获上2^nd用荧光法测定。在TNF-α实验中，在第1个头捕获的三明治免疫复合物产生的酶活性大部分(87%)被洗脱步骤中使用的DNP-Lys释放到洗脱液中，但不是所有(34%)可以被第2个头重新捕获。这种减少是免疫复合物转移方法的不利影响。从第一个头的三明治免疫复合物的洗脱进行得很理想，但由于洗脱后没有多余的抗体驱动反应，因此洗脱液中出现了不希望的Ag-Ab三明治免疫复合物的解结合。另一方面，非特异性结合检测抗体偶联物的酶活性比第一个头提高了280倍。第1粒与第2粒结合条件的最大差异是检测抗体偶联物与免疫复合物的比值。比值约为1.5 × 10⁴在…期间^圣捕获反应(在3 pg/mL的TNF-α EIA(沙-EIA的LoD))，但在2^nd俘获反应。ICT-EIA比Sand-EIA更敏感，因为非特异性信号水平大大降低，尽管特定信号水平有所降低。

Toshihiro渡边
临床创新，Sysmex公司，日本神户西西区高津台4-4-4

出版

免疫复合物转移酶免疫分析法:与传统三明治酶免疫分析法相比灵敏度提高的机制。
渡边T，桥田S
免疫学杂志，2018年8月

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