草甘膦是世界上使用最广泛的除草剂。自20世纪70年代以来，它被用于处理杂草以提高产量。多年来，由于其潜在的致癌作用和对生物多样性的负面影响，其使用一直存在很大争议。因此，人们对获取草甘膦在水、食品、环境探针等中存在的信息非常感兴趣。然而，由于草甘膦的物理化学性质，如小尺寸和高极性，检测具有挑战性。通常，检测到的是草甘膦通过色谱技术成本高，劳动强度大，需要高素质的人才。为了克服这个问题，我们的目标是开发一种快速、简单的分析方法，利用一种全新的方法广泛使用。我们没有像elisa检测那样检测草甘膦本身或使用抗体，而是利用草甘膦靶蛋白5′-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)。EPSPS是莽草酸途径的一部分，负责植物和微生物中芳香氨基酸的形成。如果草甘膦存在于周围的水或土壤中，由于EPSPS的抑制和芳香氨基酸的缺乏，植物将会挨饿。

图。可能使用孔雀石绿测定法检测草甘膦的工作流程方案。

使用这种酶，我们希望提供一种芯片形式的分析方法，使其易于处理。我们使用来自真菌的疏水蛋白将EPSPS固定在芯片表面。疏水蛋白是一种具有多种特性的蛋白质。它们能够以非常稳定和有序的方式在表面自组装。来自肠道细菌的EPSPS的融合蛋白大肠杆菌(EcEPSPS)和疏水蛋白Ccg2粗糙脉孢菌表达和纯化并用于塑料或玻璃表面的功能化，用于新的测定。该分析是基于EPSPS触发的反应。它以莽草酸-3-磷酸(S3P)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)为底物，转化为烯醇丙酮酸-3-磷酸和无机磷酸盐(Pi)。草甘膦存在时，酶被抑制，Pi水平低于不含草甘膦的对照组。Pi可以用一种简单的比色法检测，即孔雀石绿测定法。通过这种实验室设置，我们能够在纳摩尔范围内检测草甘膦(检测限为50 nm)。此外，我们的实验对草甘膦显示了很强的特异性。我们用我们的实验测试了不同的与草甘膦相关和不相关的物质，并记录了它们没有交叉反应。这是由于草甘膦- epsps反应的高特异性。据我们所知，没有其他杀虫剂专门针对EPSPS。 This is an advantage compared to some other assays which showed cross-reactions with e.g. glyphosates first degradation product. However, indirect glyphosate detection通过孔雀石绿测定具有挑战性，因为无机磷酸盐在环境中无处不在。因此，我们测试了一种预孵育方法(与图1相比)。我们首先将含有磷酸盐和草甘膦的溶液添加到我们的表面并孵育15分钟。在孵育期间，草甘膦与固定化酶特异性相互作用。之后我们用实验缓冲液替换溶液，进行孔雀石绿实验。我们发现，草甘膦的抑制作用可以很好地测量，分析物溶液中的磷酸盐几乎不会干扰我们的测定。通过这种操作方法，我们能够展示使用其靶酶检测草甘膦，并结合简单的比色测定法。

茱莉亚Döring，凯·奥斯特曼
德国德累斯顿理工大学遗传研究所Universität, Zellescher Weg 20b, 01217德累斯顿

出版

疏水蛋白- epsps融合蛋白的表面功能化使得草甘膦的检测快速简单
Julia Döring, David Rettke, Gerhard Rödel, Tilo Pompe, Kai Ostermann
生物传感器(巴塞尔)。2019年8月29日

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