基因组的非蛋白编码区被广泛转录产生非编码rna (ncRNAs)，在各种生物过程和疾病中起着至关重要的作用。新一代测序技术的最新进展表明，ncrna并不总是以具有固定末端序列的单一实体表达，而是在长度和末端序列上具有复杂异质性的多个同工异构体。

图1所示。Db-PCR示意图。

例如，在广泛调节其互补靶mrna表达的microrna (miRNA)的情况下，相同的miRNA基因编码成熟的异构体，称为异构体，其大小在miRNA的5 '和/或3 '端有一个或多个核苷酸的变化。每种miRNA的isomir在不同发育阶段的不同细胞和组织类型中表达差异，这已被证明具有生物学意义。为了揭示小RNA异质性的复杂性及其潜在的分子机制，准确定量单个小RNA变体并方便地分析其表达谱是必要的。

我们最近开发了哑铃pcr (Db-PCR)，这是一种高效、便捷的基于TaqMan rt - pcr的方法，可以在5 '端和3 '端序列上以单核苷酸分辨率特异性地定量单个小RNA变异。在Db-PCR中，5 '和3 '茎环适配器，称为db -适配器，通过T4 RNA连接酶2特异性杂交并分别连接到目标RNA的5 '和3 '端(图1)。随后通过TaqMan RT-PCR对具有“哑铃状”结构的连接产物进行定量(图1)。

图2所示。利用Db-PCR特异性定量异构体(A)和tRNA片段(B)。

我们证实，适配器连接和TaqMan RT-PCR对目标rna的高特异性确保了目标rna的5 '和3 '端序列具有单核苷酸分辨率，因此Db-PCR特异性检测目标rna，而不是其相应的末端变体。Db-PCR对不同细胞类型的各种小rna的定量具有广泛的适用性，其结果与其他定量方法的结果一致。因此，Db-PCR为小RNA变体(如isomiRs)的特异性检测和差异表达分析提供了一种高效便捷的技术(图2A)。该方法还可以揭示细胞中与丰富的前体rna共存的小rna的生物学意义，如tRNA片段，其特异性检测和定量需要与其前体rna区分(图2B)。

洋平Kirino
计算医学中心，Sidney Kimmel医学院，Thomas Jefferson大学，
美国宾夕法尼亚州费城

出版

哑铃pcr:一种在末端序列上以单核苷酸分辨率定量特定小RNA变异的方法。
本田S，基里诺Y
《核酸》2015年7月13日

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