研究表明，在细菌和哺乳动物细胞的整个生命周期中，它们最外层的脂质膜会脱落一部分，这些脂质膜通常在它们的表面和腔内含有碳水化合物、蛋白质和核酸。这些生物颗粒被称为细胞外囊泡(EV)、外膜囊泡(OMV)或外泌体在活的有机体内细胞功能包括:细胞间通讯、宿主防御机制、基因转移和毒力因子的传递。这些囊泡或蛋白脂质体越来越多地被发现在许多疾病过程中发挥重要作用，既是疾病的诊断标志物，也是人类疾病进展的指征。目前还在积极探索将EV/OMV用于治疗应用，主要指征是基于疫苗的药物领域。工程生物过程的先进科学工具使研究人员能够更好地控制EV/OMV的组成，然而，由于细胞在其整个生命周期中倾向于脱落EV/OMV，因此需要额外的工具来丰富含官方manbetx手机版有大量囊泡所需有效载荷的目标EV/OMV(图1A)。

图1所示。A)从天然无负载OMV和其他培养基污染物中选择性亲和纯化装载his标签蛋白的OMV的示意图。B和C)重组膜蛋白将组氨酸序列呈现在OMV的外部。

EV/OMV的净化可能是昂贵的，需要专门的过滤设备和长时间的超离心循环。我们试图简化EV/OMV的制备，同时对含有特定货物的EV/OMV进行富集。在一系列概念验证实验中，我们使用了重组细菌膜蛋白和合成膜锚蛋白，编码细菌OMV外部呈现的组氨酸氨基酸重复序列(图1B,C)。利用固定化金属亲和层析(IMAC)这一常用的纯化技术，我们发现我们可以从散装培养基中选择性地富集含有我们工程蛋白的OMV。该方法显著降低了与OMV净化相关的总体复杂性和成本。

在我们的手稿中，我们概述了一种简化的方案，其中过量的IMAC树脂与细菌培养基一起培养。由于每个OMV上的组氨酸表位标签的多个拷贝，因此结合的高亲和力允许批量洗涤方案，其中树脂通过低速离心轻轻成球。捕获的EV很容易通过加入竞争性小分子(咪唑)从IMAC树脂中洗脱出来。我们使用荧光显微镜和扫描电子显微镜证实了树脂捕获的工程OMV(图2A)。使用粒子跟踪仪器对纯化的OMV进行定量，以确认除了western blotting评估捕获效率和纯度外，形态学没有明显变化(图2B)。正如在western blot中观察到的那样，在流过或洗涤馏分中丢失了最小的目标OMV，表明工程OMV的高回收率。

图2所示。A) OMV与IMAC捕获树脂结合的SEM图像。B)使用抗his标签抗体对IMAC树脂中OMV的洗脱图谱进行Western blot。

虽然概念验证研究是利用细菌进行的大肠杆菌所描述的EV/OMV分离技术可应用于任何正在研究的细菌或哺乳动物系统。这种强大的纯化策略通过将外部亲和表位连接到内部修饰位点(图1B)，允许将装载的EV从未装载的EV中分离出来，这与任何其他可用的EV/OMV纯化策略不同。这种先进的纯化能力将允许生产和纯化各种制药和工业生物产品，这些产品以前由于纯度限制而被认为是不可能的。虽然在EV/OMV研究领域不断有新发现，但这种纯化工具将有助于塑造EV/OMV在制药和工业应用中的生产和利用方式。官方manbetx手机版

内森·j·阿尔维斯¹，斯科特·a·沃尔珀^2
1美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院急诊医学系
²美国海军研究实验室生物/分子科学与工程中心，华盛顿特区官方manbetx手机版

出版

利用his标签突变体对细菌外膜囊泡(OMVs)进行亲和纯化。
Alves NJ, Turner KB, DiVito KA, Daniele MA, Walper SA
Res Microbiol. 2017 2 - 3

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