为什么要研究药物、杀虫剂和其他生物活性分子对线粒体的生物安全性?
线粒体是植物和动物细胞中的大型细胞器。它们利用氧气将细胞内食物中的化学能转化为可用的能量。这个过程被称为氧化磷酸化，发生在线粒体内。克雷布斯循环反应产生一种化学物质，NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原形式)，然后被存在于线粒体内膜的酶利用，产生能量丰富的三磷酸腺苷(ATP)分子。每当需要能量时，细胞就会利用这些分子。因此，线粒体也被称为细胞的能量屋。线粒体大量存在于肌肉细胞、脑细胞和精子中，在需要能量时提供atp。监测药物、杀虫剂和其他生物活性分子对线粒体的生物安全性是必要的，因为它们中的一些与线粒体膜或膜蛋白相互作用，从而影响细胞的能量水平，甚至诱导线粒体依赖性细胞凋亡(程序性细胞死亡)。

图1所示。在没有杀虫剂(红线)和杀虫剂(0-100µM)浓度增加(红线起)、甲基对硫磷(a)、呋喃(b)、硫丹(c)和氰戊酸酯(d)的情况下，线粒体膜蛋白的荧光发射光谱。(e)甲基对硫磷(♦)、呋喃(▲)和硫丹(■)与棉铃虫分离的完整线粒体膜蛋白结合，色氨酸荧光猝灭评估。数据代表平均值±SD (n = 3)。

色氨酸荧光猝灭法测定生物活性分子与线粒体的相互作用
光的吸收促使电子进入激发态，当激发态的电子经过辐射跃迁返回基态时产生发光，这可以通过荧光光谱来测量。荧光猝灭是指降低样品荧光强度的过程。由于芳香氨基酸，主要是色氨酸，蛋白质显示荧光，可以在295 nm激发测量。色氨酸引起的发射光谱变化可以通过响应蛋白质构象转变、亚基结合、配体结合或变性来测量。正是在这种背景下，色氨酸荧光可以作为一种有价值的工具来测量膜蛋白与配体分子的相互作用。

线粒体外膜由40%的脂质和60%的蛋白质组成。这些蛋白质包括各种各样的酶、参与易位的前体蛋白成分、孔形成蛋白和介导线粒体裂变和融合的蛋白质。某些膜蛋白作为单体发挥作用，而其他膜蛋白则组装成横跨膜的低聚结构。由于它们排列的复杂性和动态性，几乎不可能在脂质双分子层模型中研究它们与任何配体的相互作用。位于蛋白质核心附近的色氨酸残基的荧光光谱可用于测量蛋白质核心处的局部构象变化。

完整的线粒体在295 nm激发时，在λ处产生两个肩的发射光谱_马克斯333和404 nm，在370 nm处有一个谷(图1)。在分离的线粒体中添加杀虫剂会导致两个肩部的荧光猝灭。由于生物活性分子的猝灭，色氨酸荧光发射可以通过λ处荧光强度的降低来测量_马克斯由于色氨酸环境的变化，蛋白质分子与杀虫剂之间形成了一种关联，这是333 nm。减少荧光强度与轻微的红移在λ_马克斯333 nm是由于色氨酸残基暴露于极性环境所致。

甲基对硫磷(类:有机磷)、呋喃(氨基甲酸酯)和硫丹(有机氯)杀虫剂通过线粒体依赖途径诱导细胞凋亡，因此对完整线粒体的色氨酸荧光猝灭有实质性影响，表明杀虫剂与细胞器相互作用。然而，氰戊酸酯——一种合成的拟除虫菊酯，通过线粒体非依赖性途径诱导细胞凋亡，当添加到线粒体提取物中时，不会导致荧光发生任何变化，因此，与线粒体膜蛋白没有相互作用(图1)。

影响
色氨酸荧光猝灭法可用于评估药物、杀虫剂和其他分子与线粒体膜蛋白的相互作用。该分析有助于了解许多化学品对目标和非目标生物的作用方式、毒性和生物安全性，特别是农药、药物和其他对环境有害的化学品。

Akbar, K老eeramulu和HC沙玛
国际半干旱热带作物研究所昆虫学官方manbetx手机版
Patancheru，泰伦加纳邦，印度
古尔巴加大学生物化学系
古尔巴加，卡纳塔克邦，印度

出版

色氨酸荧光猝灭作为一种结合试验来监测完整线粒体膜中蛋白质构象的变化。
Akbar SM, Sreeramulu K, Sharma HC。
[J]生物能源，2016年6月

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