肝纤维化是一种由病毒感染或反复接触酒精、药物或不健康食品引起的慢性肝脏疾病。在肝损伤时，一系列细胞相互作用被启动，共同试图恢复肝脏结构和体内平衡。在体外和在活的有机体内模型是研究肝纤维化通路和开发治疗方法的关键。在纤维化中起作用的四种主要肝细胞类型是肝星状细胞(hsc)、肝窦内皮细胞(LSECs)、库普弗细胞(KCs)和肝细胞(图1a)。为了进行体外纤维化研究，人们倾向于不使用这些细胞衍生的(癌)细胞系，而是研究原代肝细胞的机制和相互作用。为了从啮齿动物身上获得这些原代肝细胞，采用快速的分离程序并产生大量的纯单细胞群是有害的。肝细胞可以用成熟的Percoll梯度离心程序分离，但其他(非实质)肝细胞类型的分离方案通常更耗时，并且依赖于为单个细胞类型选择所需的昂贵抗体。

图1所示。流式细胞术可同时从小鼠肝脏分离hsc、KCs和LSECs。a.肝脏分为5万~ 10万个肝小叶(左)，由多个肝窦组成(右)。在这些窦状体中存在四种主要的细胞类型，即肝星状细胞、肝窦内皮细胞、库普弗细胞和肝细胞。改编自“肝纤维化的3D体外模型”(van Grunsven, 2017)，经Adv Drug Del Rev. b许可。基于标准细胞类型特异性抗体的分离方法和UFACS3方法的原理图平行概述。

LSECs和KCs可以通过其fc受体吸收免疫复合物，而hsc可以根据这些细胞中含有视黄醇酯的脂滴发出的自荧光信号(328nm)来识别。在本文中，我们开发了一种程序，利用这些功能特征的三种肝细胞类型的分离。给小鼠注射alexa647标记的驴抗兔免疫球蛋白G (IgG)抗体，结果仅在LSECs和KCs中快速吸收这些抗体，而在造血干细胞中没有。注射后仅2小时，通过荧光激活的非实质部分细胞分选，可以很容易地观察到这三个群体(图1b)。用细胞类型特异性标记对分选的细胞群进行免疫细胞化学染色，结果表明这些细胞群的纯度非常高:LSEC为98±1%，KCs为98±1%，hsc为97±3%。该方法对健康的Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠以及Sprague Dawley大鼠有效。更重要的是，分离过程可以有效地从患有肝脏疾病的小鼠(如四氯化碳治疗的小鼠)或接受胆管结扎的小鼠中分离出三种种群，这两种小鼠都建立了肝纤维化模型。

图2所示。具有四种不同细胞类型的肝细胞三维类器官。LSECs、hsc、KCs和肝细胞按1:1:1:1的比例形成球状体。培养4天后，用细胞类型特异性抗体染色检测到所有细胞类型;肝细胞(Hnf4a)、hsc (Desmin)、KCs (F4/80)和LSECs (Lyve-1)。

最后，我们的新隔离协议提供了一个重要的附加价值，致力于减少研究中动物的使用。官方manbetx手机版使用这种技术，至少可以从一只小鼠中分离出这四种细胞类型，与基于标准细胞类型特异性抗体的方案相比，产量更高，成本更低。完成对分离细胞、细胞功能的评价在体外进行了测试。的在体外hsc和KCs的活化以及KCs和LSECs的清除能力得分至少与传统分离方法分离的细胞一样好。此外，我们能够将这些细胞与肝细胞一起形成三维肝球体，四天后仍可检测到所有四种细胞类型(图2)。我们将这种方法称为UFACS3方法，即基于uv - fac3分离三种非实质肝细胞类型。

l . Stradiot¹，美国Verhulst¹，t . Roosens¹，C.I.世界动物卫生组织²，贝聿铭火山泥^3.，g·哈尔德^3.，
即Mannaerts¹，L.A. van Grunsven^1
1肝脏细胞生物学实验室(LIVR)，布鲁塞尔自由大学，比利时布鲁塞尔
²北京医科大学健康科学学院医学生物学官方manbetx手机版系血管生物学课题组
单位-挪威北极大学，特罗姆瑟，挪威
^3.比利时鲁汶大学VIB癌症生物学中心和鲁汶大学肿瘤系

出版

基于功能的同时分离啮齿动物肝窦细胞的方法。
Stradiot L, Verhulst S, Roosens T, Oie CI, Moya IM, Halder G, Mannaerts I, van Grunsven LA
生物材料，2017年9月

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