蛋白质有各种各样的形状和大小，但主要有两大类:可溶性蛋白质和那些驻留在膜上的蛋白质。在细胞中发现的所有蛋白质中有20-30%是膜蛋白。许多膜蛋白，如受体、转运体和离子通道，进行关键的生理过程，是大部分治疗药物的靶点。有趣的是，微生物层面的生物战也利用了膜蛋白:细菌和真菌都会产生毒素，在膜上形成毛孔，从而杀死受影响的生物体。尽管膜蛋白具有多样性，但它们只有两种可能的结构:一种主要由α -螺旋组成，而另一种是b-桶状结构(图1)。

图1所示。两种跨膜蛋白:a.由b链组成的桶状结构(人类VDAC1, Bayrhuber M et al, 2008)， b. a-螺旋结构(细菌钾通道KcsA的跨膜部分，Doyle DA et al, 1998)。

为了理解一种蛋白质是如何发挥作用的，你需要把它从细胞中发生的所有混乱中分离出来——纯化蛋白质，然后单独研究它。这在膜蛋白的情况下是具有挑战性的。净化它们需要将它们从膜上溶解——也就是说，你必须使用洗涤剂。另一种方法是在细菌细胞中表达它们，在那里它们可能会沉淀。溶解沉淀物通常需要尿素或盐酸胍(GnCl)等变性剂和洗涤剂。这可以得到一个纯蛋白质，但你不知道这是否是一个功能性蛋白质。因此，您需要验证它是否仍然能够完成预期的工作。膜蛋白通常参与将物质或信息从膜的一边转移到另一边。所以为了验证它是否仍然有效，你需要把它放回一个膜里，这样你就可以监控它的功能。为了获得纯净的功能性蛋白质，你需要对程序进行微调，特别是要使用的洗涤剂的类型和数量等因素。

离子通道是一类特殊的膜蛋白，它在膜上形成一个充满水的通道，离子(有时还有其他溶质)可以通过这个通道扩散。我们感兴趣的蛋白质，电压依赖性阴离子通道(VDAC)是一种b桶蛋白，存在于从酵母到人类的所有真核生物的线粒体外膜中。它促进呼吸所需的底物从细胞质到线粒体的吸收，以及两个室间ATP和ADP的交换。VDAC在程序性细胞死亡以及癌症和神经退行性疾病中也起着重要作用。

图2所示。以OsVDAC4为例的通道蛋白的纯化和表征通常遵循的协议示意图。

我们在特定菌株中表达了水稻VDAC异构体(OsVDAC4)。大肠杆菌BL21-DE3(图2)。制备了大量的OsVDAC4蛋白，但它形成了大的沉淀物，然后必须使用变性剂盐酸胍溶解。在变性剂和洗涤剂LDAO的存在下，通过色谱法在一种叫做羟基磷灰石的树脂上混合celite(硅藻土灰)纯化蛋白质。最后，通过透析缓慢去除变性剂，得到悬浮在洗涤剂中的纯OsVDAC4。

纯化的OsVDAC4在两种不同的膜系统中形成通道，由天然植物脂质制成的脂质体(囊泡)和由合成脂质和胆固醇制成的双层膜(电生理测定)(图2)。在脂质体中，OsVDAC4形成直径约2.6 nm的孔，可运输多种溶质。

在平面双层结构中，OsVDAC4形成高电导(4.6±0.3 nS)通道。该通道在没有电场的情况下最大限度地打开，并且在有电场的情况下经历构象变化到部分封闭状态。最大开放状态允许ADP和ATP通过，而部分封闭状态则不允许。

综上所述，人工膜系统中通道蛋白的纯化和表征可以为研究通道蛋白的功能提供有用的工具。该技术可以扩展到研究蛋白质-蛋白质相互作用以及药物-蛋白质相互作用的细节。

Ashwini Godbole, Ashvini Kumar Dubey, sahill Lall一个nd马修

出版

OsVDAC4的表达和纯化。
Godbole A, Dubey AK, Mitra R, Reddy PS, Mathew MK。
方法:酶学杂志。2015

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