基因表达的核心原则通常是从DNA编码序列到RNA转录本，然后到蛋白质。因此，基因的正常功能可能会被抑制，或所谓的基因“沉默”，通过转录物切割而中断。事实证明，这种沉默已经成为研究基因功能甚至帮助改善作物性状的有效方法。这是因为通过基因沉默减少或丧失基因功能可能与所研究植物的表型和性状利用有关，当性状受该基因控制时。实现沉默的传统方法是使用携带转基因表达单元的遗传结构一次沉默一个基因。然而，随着基因数量的增加，同时沉默这些基因的难度急剧增加，因为必须部署多个转基因表达单元，这给将这些单元组装成遗传结构带来了挑战，并促进了多个表达单元之间不必要的相互作用。

图1所示。利用atasiRNA的tc克隆技术示意图。两个Xcm I位点可以被整合到TAS(反式作用小RNA)位点的两个适当位置。限制性内切酶将在Xcm I位点产生T-和C-突出端，以接收传入的编码atasiRNA的21-bp DNA，该DNA可以合成为两个独立的，反向互补的单链DNA，具有一个核苷酸的A-和G-突出端。蓝框显示成熟的miR173ts(例如)作为触发序列，在切割时触发21bp atasiRNA的产生。括号D1到D8表示将从中生成atasiRNA的注册器位置。中间和底部的图显示了tc克隆站点的放大。

最近,人工反式-作用小干扰RNA (atasiRNA)已成为一种有效的特异性基因沉默平台。与传统方法相比，该技术不仅能够以最少的转基因表达单元(1-2个)同时沉默多个基因，而且还将沉默非预期基因的风险降至最低。从机制上讲，多个21bp长的atasiRNA转录物是由植物内源产生的反式-作用小RNA位点(助教)或从基因结构携带助教整合到植物基因组中的位点。利用atasiRNA技术的关键是鉴定每个21 bp的atasiRNA物种，这些物种需要足够的效力和特异性来切割其靶基因转录物。要做到这一点，一个实用的方法是使用在线小RNA预测程序确定一个顶级候选21 bp RNA列表。一旦这些候选atasirna被发现，它们中的每一个都需要被验证在体外或在活的有机体内来决定哪一个是最有效的。这个过程需要高强度的工作，将编码21-bp atasiRNA的短DNA列表中的每一个克隆到DNA中助教轨迹。使用传统的克隆方法实现这一目标将具有挑战性，而且成本低。为了克服这一瓶颈，我们开发了tc克隆技术，该技术可以高效和定向地克隆编码atasiRNA的每个21bp DNA助教轨迹。确保21bp atasiRNA在dna中的方向性的能力助教基因座是确保有效基因沉默的重要因素。该tc克隆成功的关键是通过结合限制性内切位点生成T-和C-单核苷酸突出端Xcm我进入了助教轨迹。XcmI序列是通用的，足以允许产生T和C端。tc克隆的高效率和保真度使得利用atasiRNA沉默平台成为可能，突破了克隆极短的21bp atasiRNA编码dna的瓶颈(图1)。

图2所示。以miR173触发器为例，miRNA触发器与TAS表达单元融合示意图。MiR173、MiR173前体序列;miR173ts，与miR173互补的miR173触发序列;TAS，反式作用小RNA位点。

此外，我们开发了一种简化的atasiRNA生成系统，该系统可以实现统一的基因沉默，并最大限度地降低寄主植物的致死率(由严重的基因沉默引起)。现有的atasiRNA平台需要共表达助教基因座和miRNA触发，因此需要两个独立的表达单元。在基因结构中组装两个独立的表达单元可能会给克隆工作带来挑战，导致两个表达单元之间的不良相互作用，并增加解除管制的成本。通过简单地融合miRNA前体和助教由此产生的单元可以由单个启动子驱动，易于组装并避免传统两个独立单元之间的不良相互作用(图2)。

最后，该新技术将有助于植物生物学研究和作物遗传改良的性状堆积。

张占元
植物科学部植物转化核心设施，
密苏里大学，哥伦比亚，密苏里，美国

出版

利用人工反式作用小干扰RNA高效克隆编码DNA和均匀沉默植物基因的新构建物。
Baykal U，刘辉，陈旭，阮合辉，张志军
植物细胞大会2016年10月

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