成纤维细胞是合成胶原蛋白的细胞，支持皮肤、肌腱和关节中的结缔组织的维持。它们通过促进损伤和炎症部位的伤口愈合，在免疫系统对组织损伤的反应中发挥关键作用。我们的实验室对成纤维细胞在急性和慢性疼痛的发展和白细胞浸润中的作用感兴趣。因此，我们设计了一种新的多学科技术来研究这些细胞在体内的活化。我们创造了一个基因报告动物，荧光标记成纤维细胞亮红色(tdTomato)，并利用下一代成像，多光子显微镜。该技术允许用户创建延时视频和/或蛋白质与整个成像组织的活细胞相互作用的图片，并提供组织中微环境的精确模型。

图1所示。tdTomato仅在FSP1+成纤维细胞中以Cre依赖的方式表达。A)具有代表性的PCR结果，描绘了表达tdTomato的成纤维细胞特异性蛋白1cre (FSP1cre)阳性和阴性的小鼠。B)在C57BL/6背景下培育的FSP1cre转基因小鼠与在C56BL/6背景下培育的tdTomato小鼠杂交，产生在FSP1+成纤维细胞中以cred依赖方式表达tdTomato的小鼠。C)具有代表性的象形图，显示tdTomato阳性成纤维细胞上表达的TLR4对荧光标记的激动剂的摄取，以及注射激动剂后，全身没有TLR4的小鼠(TLR4KO)缺乏对激动剂的摄取。

免疫系统是人体抵御外来入侵者的第一道防线。细菌成分由成纤维细胞表面的受体toll样受体4 (TLR4)识别。我们使用了一种模拟细菌与TLR4结合的激动剂。当这种受体被激活时，它会引起炎症介质的产生，并改变细胞外基质的组成。我们和其他人相信这种激活的表型可以促进白细胞向炎症部位的募集。

通过使用荧光标记的TLR4激动剂(绿色荧光蛋白)和我们的报告小鼠，我们能够实时可视化成纤维细胞和激动剂之间的相互作用。我们发现，在给药后，表达TLR4的成纤维细胞与激动剂结合，发生高水平的共定位。相比之下，全身没有TLR4的小鼠(TLR4^KO)不结合激动剂。

利用所描述的方法提供了优于现有方法的好处，可以实时可视化细胞的激活。在活的有机体内实验提供了一个更准确的洞察细胞的功能状态和它们在组织中的相互作用。此外,在活的有机体内影像学降低了组织分离创伤引起的混淆结果的可能性。此外，在实验设置，这需要连续和延长的成像会议，多光子显微镜具有损害的光敏荧光团率下降。

Zachary Castillo, Thomas A. Szabo-Pardi, Michael D. Burton
高级疼痛研究中心(CAPS)神经免疫学和行为实验室，
行为与脑科学学院神经科学系，
德克萨斯大学达拉斯分校，美国

出版

皮肤遗传标记报告细胞的体内双色双光子成像
Szabo-Pardi TA, Agalave NM, Andrew AT, Burton MD
J Vis Exp. 2019年7月11日

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