蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析是从基础分子生物学到诊断和药物开发等各个领域的关键技术。以前，PPI检测一般采用荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)和蛋白片段互补(PCA)。基于FRET和bret的分析方法是既定的方法，其重复性高。为了进行这些检测，通常使用荧光蛋白和荧光素酶，然而，由于信号强度与6负相关，大蛋白之间的相互作用难以检测^th探测器之间距离的功率。此外，可达到的信号/背景(S/B)比率相当低。另一方面，PCA是一种用户友好的分析方法，具有较高的S/B比，并且可以使用许多酶和荧光蛋白。然而，由于探针的分裂形式，信号强度和稳定性较低。

图1所示。

为了克服这些传统方法的问题，我们利用萤火虫荧光素酶(Fluc)反应的独特性质开发了一种新的PPI测定方法。也就是说，Fluc的发光反应可以分为两个半反应，即腺苷酸化步骤和随后的氧化发光步骤。在腺苷化过程中，d -荧光素与ATP反应生成中间产物荧光素-腺苷酸(LH)₂-AMP)，而在接下来的步骤中LH₂-AMP加入氧，脱羧，转化为发光的氧荧光素(OxL)。为了检测PPI，我们制作了两个自身没有发光活性的突变体Flucs。一种叫做供体的突变体在转化LH方面有缺陷₂-AMP到OxL。另一方面，另一种被称为Acceptor的突变体在将d -荧光素和ATP转化为LH方面存在缺陷₂amp。当供体和受体各自与相互作用的蛋白质融合，并由于相互作用而接近时，供体提供LH₂-AMP到受体，受体产生OxL发光。我们将这种PPI试验命名为fireflyluminescent我山米ediate-basedprotein我nteraction一个ssay FlimPIA。

菲律宾已经表现出几个优点在体外PPI化验。首先，与FP-FRET法和Fluc PCA相比，可以检测到较大蛋白质之间的相互作用，因为FlimPIA的信号强度随着探针之间的距离降低得更慢。其次，获得的S/B比高于其他测定法。三是PPI的检出限最低。第四，探针的稳定性高于Fluc PCA，这可能是由于使用了全长酶作为探针。第五，信号强度高于Fluc PCA。尽管flipia表演了在cellulo目前提供的好处较少，我们相信很快就会改进。

flipia是基于补偿酶的催化步骤的独特原理。Fluc属于酰基/腺苷酸形成酶超家族。该超家族酶催化的化学反应均由两个半反应组成，其中包括一个腺苷化步骤，其中将应用FlimPIA原理。希望通过使用该酶家族中的其他酶，可以开发出更有用的PPI测定方法和其他应用。

大室松山由纪，上田宏
日本东京大学工学院化学与生物技术系
化学资源实验室，东京工业大学，日本横滨

出版

通过铰链区工程和优化反应条件，获得了基于萤光素酶的超灵敏蛋白相互作用测定(FlimPIA)。
栗原M，大室松山Y, Ayabe K，山下T，山司H，上田H
2016年1月

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