呼吸道合胞病毒的快速鉴定
呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿严重下呼吸道疾病的主要病因。RSV鉴定的快速、简单、准确的空斑测定是RSV研究中最重要的程序之一。在这里，我们报告了一种新的RSV斑块检测方法，使用免疫染色。该试验可在感染后2天完成，比结晶紫染色更早观察到菌斑。该方法具有简单、快速、重复性好等优点，可用于斑块减少试验评价药物效果。该方法可灵敏、快速地从小鼠肺标本中滴度病毒。该试验将区分病毒诱导或介质(如细胞因子/趋化因子)诱导的生物样品(如小鼠肺匀浆)中细胞裂解的细胞死亡。
图1所示。来自Hep-2细胞或小鼠肺的斑块。A.在6孔板中培养HEp-2细胞，用连续稀释的病毒(10^-3,10^-4,10^-5)感染。平板与病毒在37℃下孵育1小时，之后每孔加2 mL覆盖层。孵育2天后，对细胞进行免疫染色、观察和拍照。对照组:未感染细胞。B.对于小鼠肺部的斑块，小鼠感染RSV A2，并在感染后第4天收集肺组织。在两张载玻片之间用1ml的DMEM培养基将单个肺完全切碎。匀浆1000rpm离心旋转10min，上清液依次稀释(10^- 1,10 ^- 2,10 ^-3至10^- 3,10 ^-6)。在Hep-2细胞与病毒孵育后第2天观察肺样品中的斑块。
获得快速准确的斑块计数是rsv相关研究的一个非常重要的方面。RSV A2病毒生长相对缓慢，通常需要4-7天才能形成可见的斑块。这些可见的斑块来自于裂解的细胞。当斑块足够大时，围绕裂解细胞的存活细胞可以用各种染料染色。HEp-2和Vero细胞已被用于RSV的斑块测定。HEp-2细胞比Vero细胞产生更大的斑块;此外，Vero细胞需要更长的时间(7 - 9天)来产生针尖斑块。RSV的临床分离株已在Vero细胞和HEp-2细胞中进行了测试，并在Vero细胞中产生了不良斑块。因此，我们使用HEp-2细胞来优化我们的斑块测定方案。我们发现在感染后4 - 6天只有75% - 95%的细胞被溶解。因此，使用中性红或结晶紫进行空斑测定的准确度仅为75% - 95%。 With our immunostaining of the current method, infected cells (plaques) could be accurately observed by eye by day 2. We found that plaque count wasn’t accurate after longer incubation time for virus since 2 or 3 plaques nearby merged into one plaque which caused plaque bigger following the longer virus incubation, resulting in reduced plaque counts.
我们的空斑测定快速而简单，病毒孵育只需2天，免疫染色只需50分钟，而以前描述的测定需要大约4-7天的病毒孵育和1小时到数天的染色。我们的覆盖层仅由0.8%琼脂组成，而其他报道的覆盖层需要复杂的试剂，如FBS, FCS或甲基纤维素。因此，我们的分析非常快速和简单。我们的菌斑测定也可以用肉眼计数。据报道，基于流式细胞术的rsv特异性中和试验快速，高灵敏度和可重复性。然而，它需要流式细胞仪，而不是每个实验室都有。总的来说，我们的空斑测定比其他已发表的方法更快速、更简单。在我们目前的研究中，使用抗rsv融合蛋白单克隆抗体进行免疫染色，这似乎很昂贵。然而，新发表的研究表明，用抗rv P单克隆抗体免疫染色，狂犬病毒诱导的斑块形状比结晶紫染色更清晰，这支持了我们在本研究中提出的免疫染色斑块测定的优势。
图2所示。用空斑试验鉴定病毒。对不同天(第1、2、3、4、5、6天)产生的斑块进行免疫染色并进行比较。HEp-2细胞在6孔板中生长，用10^3稀释的病毒感染。分别于感染后第2、3、4、5、6天肉眼和显微镜下观察斑块。
总之，我们开发了一种快速、简单、灵敏的鉴定HRSV的空斑试验。在该试验中，在感染后第2天，斑块可以通过肉眼直接观察到。染色板可以永久保存以备将来参考。该方法对所有与RSV疾病相关的研究都有重要影响。
浮石全
韩国首尔庆熙大学医学院医学动物学系
出版
一种快速、简单、准确的人呼吸道合胞病毒(HRSV)空斑测定方法。
金健，金安，朴毅，李建辉，权福生
免疫学杂志。2017年7月
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