阿尔茨海默病(AD)是一种无法治愈的疾病，它会导致记忆力、推理能力和思维能力随着时间的推移而恶化。阿尔茨海默病的特点是大脑萎缩，脑细胞外有一种叫做淀粉样蛋白的小肽斑块状沉积，脑细胞内有一种叫做tau的蛋白质缠结。虽然斑块不再被认为是导致AD的原因，但目前认为有毒的小聚集物(寡聚物)在AD的过程中起作用。为了研究ß肽如何与AD有关，我们需要纯的ß。不幸的是，化学合成的Aß肽(Aßsyn)很难使用，因为它需要极强的溶剂来溶解。为了克服这个问题，我们为asass创建了一个基因，并在asass的起始(N -氨基端)或末端(c -羧基端)添加了一个由6个额外赖氨酸氨基酸(6K)组成的溶解度标签，以确定哪种添加使asass更具水溶性。然后我们改造了细菌(Esherichia杆菌)来“表达”该基因，并大量生产经过修饰的β肽。

图1所示。一种性能较好的β肽的生成和表征。我们在α -肽的起始(n -氨基末端)或末端(c -羧基末端)添加了一个水溶性标签(6赖氨酸- kkkkkk)，以确定哪种添加增加了α -肽的溶解度。(a)将KKKKKK添加到asass的起始部分(a ß 6kn)可以在纯化过程中形成凝胶，而(b)将KKKKKK添加到asass的末端(a ß 6kc)可以增加细菌中的表达。Aß6KC更易纯化。我们使用三个不同的色谱步骤纯化Aß6KC，在最后一步之前去除亲和标签(Histidine 6X标签)。Aß 6kc的行为与合成ß类似，形成蛋白凝胶上的低聚物(二聚体、三聚体)，形成结合硫黄素T (ThT)并发出荧光的斑块。它还形成了通过透射电子显微镜(TEM)观察到的斑块。核磁共振(NMR)光谱显示，Aß 6kc具有其他ß蛋白的预期序列和形状。

当6K被加到开始时(Aß6K_N)，该肽在细菌中表达较差，难以纯化。它形成了一种凝胶，使我们无法进一步提纯它。当6K标签添加到末尾时(Aß6K_C)，该肽表达良好，易于纯化。我们使用亲和、离子交换和反相色谱三种不同的分离技术纯化Aß6K_C．然后我们测试了Aß6K_C表现与Aßsyn相似。使用交联剂，我们用化学方法捕获了a ßsyn或a ß 6k_C低聚物，并将其可视化在一种根据大小分离分子的凝胶上。我们预计会看到Aßsyn或Aß6K_C簇:二聚体，三聚体，四聚体和更大。我们的ß6 k_C除了形成更多的二聚体和三聚体外，与Aßsyn聚集相似。我们测试了Aß6K_C可以利用一种叫做硫黄素T (ThT)的标记物形成斑块，这种标记物与斑块结合，当更多的斑块形成时发出荧光。ß6 k_Ca ßsyn和a ß 6k可以形成斑块，在相同的程度和相似的时间范围内发出ThT荧光_C形成斑块的速度快了几分钟。这是意料之中的，因为之前的报道表明，细菌纯化的ß聚集速度比Aßsyn快。然后我们检查了Aßsyn和Aß6K_C通过透射电子显微镜观察斑块形成前后。ß6 k_C与具有不同大小聚集体的Aßsyn相比，聚集前的肽更均匀(所有肽聚集体大小相同)。在聚集和斑块形成后，Aßsyn斑块比Aß6K更明显_C斑块。然后我们测试了Aß6K中的单个氨基酸_C都有类似的组织，Aß6K_C通过核磁共振(NMR)光谱学分析，它与其他asas具有相同的形状。对于核磁共振，我们需要一种在核磁共振中“可见”的具有特定氮和碳同位素的肽。我们用同位素标记的氮(氯化铵)和碳(葡萄糖)培养细菌，并纯化了同位素标记的Aß6K_C．标签为Aß6K_C很容易溶于水，并用于专门设计的核磁共振实验，使我们能够绘制出这种肽的结构和原子细节。这种表现良好的，水溶性的，方便表达的asas形成斑块，并可以诱导形成低聚物，这被认为有助于AD的过程。我们计划对纯化的低聚物进行更多的核磁共振实验，以了解它们如何相互作用，并发现潜在的药物来中断这种低聚过程并阻止AD的进展。

LeVatte MA, Lipfert M, Ladner-Keay C, Wishart D S
加拿大埃德蒙顿阿尔伯塔大学生物科学系和计算机科学系

出版

高可溶性a β 1-42肽变体的制备和表征
LeVatte MA, Lipfert M, Ladner-Keay C, Wishart D S
Protein Expr Purif. 2019年12月

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