由于抗生素耐药性，细菌感染越来越难以用抗生素治疗。关于细菌如何繁殖的知识需要得到深刻的扩展，这是开发发现新抗生素的新方法的要求。细菌细胞分裂可能是一个很好的抗生素靶点，因为许多涉及的蛋白质是细菌所特有的。细菌大肠杆菌被两个脂质层包裹，形成一个内腔和一个外腔。两层之间的空间称为周质，其中包含肽桥接糖网肽聚糖(PG)层。PG层为细菌细胞提供其形状并保护其免受外界压力。PG层是不断(重新)构建的，因为它需要促进细菌的生长。PG层对细菌生存的重要性以及合成它的酶的独特性使它成为新抗生素的一个有吸引力的靶点。众所周知的β -内酰胺类抗生素使合成PG层的一些酶失效。这会破坏PG层的稳定性，导致细菌最终死亡。大肠杆菌已经发现了一种有趣的方法来保护自己不受-内酰胺类抗生素的影响:它可以使抗生素失活或主动挤出抗生素，但也可以利用不受抗生素影响的酶构建替代的PG层。构建替代PG层的一个重要步骤是由一类称为羧基肽酶的酶来完成的。先前的研究表明，羧基肽酶通过称为二聚体的对相互作用发挥作用，并定位于活性pg层合成的位点。我们的目的是研究它们在活细胞中不同活性条件下的自相互作用。

图1所示。大肠杆菌包膜的示意图，强调外周质。阳性和阴性对照我们的质周FRET测定显示，以及他们的能量转移率。测定的羧肽酶自身相互作用(框内)表明，在底物可用性或突变失活时，能量传递率增加。无论羧基肽酶是由于没有底物而失活，还是由于突变而失活，抑制的相互作用都显示出更多的能量转移。

测量活细胞中蛋白质相互作用的首选方法是Förster共振能量转移(FRET)。FRET需要两个兼容的荧光蛋白(FP)在如此近的距离，一个(供体)的能量转移到另一个(受体)。FPs可以方便地用于标记任何感兴趣的蛋白质，然后通过荧光检测到。如果对两个感兴趣的标记蛋白检测到FRET，则它们非常接近并且可能相互作用。

由于大多数FPs在周质中不起作用，因此FRET检测无法用于周质。因为这是羧基肽酶存在的地方，我们必须自己开发一个实验。我们发现FPs在周质中的表达在高浓度时会对细胞产生毒性作用。然而，已知在外周质中荧光的红色FP mCherry (mCh)可以表达，但对细胞的毒性有限。绿色FP mNeonGreen (mNG)在结构上与mCherry相似，在毒性降低的周质中出现荧光。mNG和mCh的生物物理性质是相同的表达时，无论是在周质或在细胞内部。mNG和mCh一起用于活细胞的FRET试验，显示了主要羧基肽酶的自相互作用的活性差异大肠杆菌。这很有趣，因为这些酶在结构上非常相似，并且被认为具有冗余的功能。突变失活羧基肽酶显示FRET增加，表明它们具有不同的构象，可能是因为FPs之间的距离缩短了。通过去除野生型羧基肽酶的基本底物(通过抑制上游酶)迫使其失去活性，证实了这一假设。此外，我们观察到表达不活跃的羧肽酶会导致畸形细胞，而如果只是删除活跃的变体，细胞看起来是正常的。由此我们发现，羧基肽酶的不活性与它们的缺失不同，这表明它们在功能上有更多的变化。通过我们的工作，我们为科学界提供了第一个质周FRET测定，并应用它来证明羧基肽酶的活性相关构象变化，为细菌如何繁殖提供了新的见解。

尼尔斯·y·梅索恩，坦内克·登·布劳文
中国科学院生命科学研究所，细菌细胞生物学与生理学，
阿姆斯特丹大学，荷兰阿姆斯特丹1098 XH科技园904

出版

大肠杆菌体内周质Förster共振能量转移试验揭示的d,d-羧基肽酶活性相关构象变化。
刘建军，刘建军，刘建军
MBio。2017年9月12日

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