细胞是生物体维持生命的结构和功能的基本单位。生物体的表型在很大程度上是由每个细胞分子水平上的蛋白质决定的。基因表达失衡可引起蛋白质功能和细胞代谢紊乱。在真核生物中，由于预成熟信使RNA (pre-mRNA)具有维持内源性生物过程所需的巨大编码能力，因此转录后基因调控(PTGR)被认为是一种有助于指导各种前mrna的命运的途径，包括RNA加工、运输、定位、翻译和降解。rna结合蛋白(RNA-binding proteins, rbp)具有rna结合能力，并通过形成核糖核蛋白复合物(ribonnucleoprotein complexes, RNPs)发挥作用。所有mrna在其一生中都应通过PTGR途径受到信使rna结合蛋白(mrbp)的调控。

图1所示。拟南芥叶肉原生质体mrna结合蛋白组的优化mrna相互作用捕获方法流程图

一种更快速的全基因组rbp预测方法依赖于利用蛋白质序列、结构和蛋白质- rna对接的计算策略。然而，对于的信息在网上策略通常基于众所周知的典型rna结合域(rbd)。这可能会导致最近报道的包含非规范rbd的兼职rbp的出现的偏见。因此，发展在体外和/或在活的有机体内方法对补充至关重要在网上策略。利用an技术，首次在人HeLa、HEK293和HuH-7细胞系、胚胎干细胞(ESCs)和酵母细胞中鉴定了全基因组mrna结合的蛋白质组在活的有机体内这种方法被称为“mRNA相互作用组捕获”，它允许从生理细胞环境中全面探索功能性mrbp。该方法依赖于在活的有机体内紫外交联核酸和蛋白质，然后是下拉，严格的信使RNPs (mRNPs)纯化程序和蛋白质质谱(MS)。在活的有机体内高强度紫外线照射(254 nm, UV- c)的交联可以在核苷酸和蛋白质残基之间形成共价键，其范围仅为几埃(Å)，被认为是“零长度”。

优化的mRNA互作体捕获方法在植物叶片叶肉原生质体中的应用
与酵母和哺乳动物细胞中mrna结合蛋白质组的研究相比，植物mrna结合蛋白质组的发现仍处于早期阶段。尽管如此，该方法最近已被应用于植物mrna结合蛋白质组的研究拟南芥芥黄化的幼苗、叶组织和根细胞，表明该方法在检测植物功能性rbp方面具有广泛的应用前景。在此，我们提出了将其应用于mRNA相互作用组捕获方法的优化系统方案拟南芥叶肉原生质体(即没有细胞壁的细胞)，这是一种用于功能细胞测定的细胞类型。整个方法需要在活的有机体内UV交联，下拉，用寡聚dt珠纯化mRNPs，随后用MS鉴定mrbp，这类似于报道的酵母和哺乳动物细胞的相互作用组捕获方法(图1)。

图2所示。已鉴定的mrna结合蛋白质组的三类分类(左)和三类分类的饼状图(右)。已鉴定蛋白质的数量以数字列出。

该协议的重要性:提供最佳条件
最佳的蛋白质产量取决于起始组织的数量和紫外线照射的持续时间，这在协议中已经说明了。这使得研究人员在使用原生质体研究官方manbetx手机版RBP-RNA相互作用组时更有效地工作。同时，在与其他植物细胞类型和物种进行比较时，所鉴定的mrna结合蛋白质组包含具有rna结合能力的过度代表的注释rbp和新型兼职rbp，可以作为参考列表(图2)。

志诚张
鲁汶大学生物系，比利时鲁汶3001

出版

从叶肉原生质体中捕获的紫外交联mrna结合蛋白。
张忠，Boonen K, Ferrari P, schools L, Janssens E, van Noort V, Rolland F, Geuten K
植物方法。2016年11月3日

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