纳米级初级纤毛中钙信号的测量方法

纤毛是细长的微管细胞器,从大多数贴壁细胞的顶膜突出。对初级纤毛机械感觉功能的研究已经证明它是一个重要的细胞器。当暴露于液体流动时,柔韧的纤毛弯曲并诱导细胞内钙离子(Ca2 +)流入,然后是Ca2 +在整个细胞中增加。最初的内流归因于纤毛膜中多囊素的机械感觉复合物。Ca2 +在生物系统中作为次级信使是必不可少的,并参与各种功能,如调节血管张力,神经递质释放,肌肉收缩,免疫反应等。因此,纤毛Ca2 +响应流体流动的内流可作为纤毛功能的功能性读数。功能纤毛钙的研究与测量技术2 +这些变化对于理解由于纤毛功能失调而发生的变化是至关重要的。超过20种纤毛病,一种慢性多系统疾病,已被确定,这进一步加强了研究纤毛钙改变的必要性2 +活细胞模型中的信号传导。

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图1所示。5HT6-mCherry-G-GECO1.0单细胞和纤毛成像。图像显示(从左至右列)用于跟踪纤毛的DIC, mCherry荧光纤毛标记,Ca2 +敏感的GECO1.0和EGFP/mCherry的伪色比率显示Ca2 +的水平。当流体流动时(从上到下的时间序列),纤毛弯曲诱导细胞质和纤毛质中的Ca2+增加。
改编自Pala, R., Mohieldin, A. M., Shamloo, K., Sherpa, R. T., Kathem, S. H., Zhou, J.等人的许可。通过特异性靶向细胞器的个性化纳米疗法改善血管性高血压。纳米材料学报,1999,9(4):994 - 914。版权所有2018年美国化学学会。

研究活细胞纤毛的关键挑战之一是纤毛的微小大小和方向。初级纤毛的直径约为200nm,不幸的是与细胞单层呈垂直方向。这限制了观察纤毛和细胞质的选择,因为它们在不同的视角上。第二,传统Ca2 +由于选择性地排除了大多数细胞成分和外源化合物,指标不能到达纤毛质。为了克服这一挑战,目标模块被用于将货物运输到纤毛中。例如,5HT6- mcherry - g - geco1.0含有来自5 -羟色胺受体5HT6的纤毛靶向序列(图1)2 +传感器G-GECO1.0用Ca改变GFP的荧光强度2 +的水平。此外,恒定的mCherry荧光标记不依赖于Ca2 +助光剂用于纤毛运动可视化、伪影校正和数据比例分析。钙指示剂的种类繁多,在评估指示剂对钙的动态范围、亲和度(Kd)等关键特性后,严格根据研究人员的需要来选择官方manbetx手机版2 +反应动力学和靶向能力。

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图2所示。灌注室中带有细胞的微丝。(A)在图中,将垫片放置在成像盘上,使微丝平行于流动方向。使用较低的放大倍数,我们可以观察到在金属丝边缘生长的细胞。在更高的放大倍数下,向外突出的纤毛应该变得更加清晰。我们专注于单个细胞,捕获Ca2 +响应流体流动的数据。(B)实验装置原理图,该装置采用截止阀将缓冲液加载和卸载到循环中。

在我们的实验设置中,细胞被播种在涂有胶原蛋白的微丝上,然后用5HT6-mCherry-G-GECO1.0构建体转染(图2A)。需要适当的显微镜设置,能够以符合研究人员需要的速度快速获取GFP和mCherry信号。官方manbetx手机版成像室搭建完成后,静息Ca基线测量2 +获得5分钟,然后用蠕动泵引入流量。GFP强度作为时间的函数,在流体流动开始时信号强度会增加。根据实验需要,缓冲液或处理可以使用截止阀来引入新的灌注液,同时消除初始循环缓冲液(图2B)。在每个实验中,最小荧光强度测量期间Ca2 + -含有EGTA和离子霉素的游离溶液。离子霉素/EGTA处理引起细胞外钙的短暂增加2 +从离子霉素诱导的孔隙形成中进入,随后钙离子浓度缓慢下降2 +信号,由于Ca2 +螯合剂EGTA。相反,Ca2 +(10mM),以获得最大信号。这些步骤确保传感器保持动态范围(或Kd),并响应环境Ca2 +浓度。

Rinzhin T. Sherpa, Surya M. Nauli
美国查普曼大学生物医学与制药科学系,加州尔湾92618
美国加州大学尔湾分校肾内科,加州尔湾92697
内华达大学药学系,内华达州里诺89557

出版

单个活细胞中细胞质和纤毛质钙的测定
Rinzhin T Sherpa, Rajasekharreddy Pala, Ashraf M Mohieldin, Surya M Nauli
《细胞生物学》,2019

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