非分裂细胞的基因组编辑:需要新的策略

虽然个别罕见,但遗传疾病总体上构成一个普遍的健康问题。由于这些疾病的病因是有缺陷的基因,基因治疗将能够解决所有这些疾病。最新的基因治疗方法被称为基因编辑。基因编辑是利用分子剪刀如CRISPR/Cas9来修复基因的缺陷(图1)。CRISPR/Cas9是该系统中最常用的类型,它由两部分组成,Cas9蛋白可以在DNA中进行切割,而向导RNA是一种RNA分子,与Cas9结合并引导其走向特定的20个碱基的目标序列。CRISPR/Cas9允许我们通过在突变位点附近产生DNA双链断裂(DSB)来切割人类基因组。这种DSB通过两种主要的细胞修复途径感知,即非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。

非分裂细胞的基因组编辑:需要新的策略

图1所示。CRISPR / Cas9系统。Cas9和sgRNA靶向序列原间隔器,前提是存在一个3 ' PAM序列(NGG)。切割位置用黑色剪刀表示,位于PAM序列上游3个碱基处。(Nami et al., 2018)。

虽然NHEJ通常被认为是一种容易出错的途径,导致DNA碱基的插入和缺失(indels),这是独立于修复模板发生的,但HDR依赖于修复模板的存在来重新填充正确的碱基,被认为是一种无差错的途径。因此,HDR已被广泛测试并用于精确的基因编辑。鉴于HDR仅限于细胞周期的S期和G2期,仅存在于分裂细胞中,这种方法可能不适合编辑和修复非分裂细胞中的基因组。然而,许多单基因疾病导致疾病,是因为不同器官中终末分化的非分裂细胞的功能受损。因此,为了逆转由单基因疾病引起的缺陷,需要能够纠正非分裂细胞中遗传缺陷的疗法。最近,已经开发了几种新的基因组编辑策略,这可能使纠正非分裂细胞中的基因突变成为可能。根据对修复(供体)模板的依赖性,这些策略可以分为两大类(图2)。供体依赖方法主要是基于插入DNA片段,而供体独立策略是基于删除、制作索引、改变碱基或反转目标序列。因此,供体依赖策略主要用于逆转大缺失等大规模突变,而供体独立策略主要用于通过干扰突变基因的序列来逆转功能突变的增益。应该提到的是,除了碱基编辑之外,这些策略都不允许精确和无疤痕的突变修复。碱基编辑是直接用正确的DNA碱基替换单个DNA碱基,而不产生DSB,因此不依赖于HDR。 Base editor (BE) is an engineered fusion enzyme consist of Cas9 and cytidine deaminase (CD) that enables a C-G to T-A conversion in an activity window that can be as narrow as 1-2 bases. Since the initial description, BE has been extensively improved and expanded.

体内非分裂细胞的候选基因编辑方法

图2所示。体内非分裂细胞的候选基因编辑方法。
(a和b)捐助方独立方法,(c和d)捐助方依赖方法。带虚线轮廓的方框是潜在的方法,没有足够的实验证据证明它们可以在非分裂细胞中编辑基因(b和d)。在每个方框中,左列列出了每种方法(用粗体字母表示)和策略,中列列出了每种方法的靶向突变,右列显示了每种方法的示意图。
(右列):粉色外显子,红色星号表示突变外显子;虚线表示拼接模式;绿色三角形表示操作部位;Stop:停止密码子;PA:聚A序列。
(方框' a '):以隐式外显子(crypt ex)为例。
(框' c '):带有锯齿边的粉色外显子2表示缺失。
BE:碱基编辑器,BE3, BE4和YEE BE3是由BE3发展而来的其他BE, HITI:同源不依赖的靶向整合,HMEJ:同源介导的末端连接,专性连接门状重组,PITCH:精确整合到目标染色体,recCas9:重组酶Cas9, target - aid:与BE3非常相似的碱基编辑系统,使用不同的胞苷脱胺酶。(Nami et al., 2018)。

另一个重要的碱基编辑工具是腺嘌呤碱基编辑器(ABEs),它含有DNA腺苷脱氨酶而不是CD,并使T-A向C-G转变。考虑到目标突变(C-G到T-A)占人类已知致病性点突变的一半,ABE是碱基编辑的一个重要里程碑。BE和ABE的一个重要限制是点突变应该落在目标序列的活动窗口内。此外,使用碱基编辑仍然不可能逆转Transversion(嘌呤为嘧啶碱基的交换)突变或其他小规模突变,如indel。因此,需要开发其他基因组编辑策略来精确修复小规模突变。

Fatemeharefeh Nami1侯赛因·巴哈维德2、3凯瑟琳Verfaillie1
1比利时鲁汶大学斯坦塞尔研究所发展与再生部
2伊朗,德黑兰,ACECR, Royan干细胞生物学与技术研究所,细胞科学研究中心,干细胞与发育生物学学系官方manbetx手机版
3.伊朗德黑兰科学与文化大学发育生物系

出版

非分裂细胞的体内基因组编辑策略
Nami F, Basiri M, Satarian L, Curtiss C, baharand H, Verfaillie C
趋势生物技术。2018年8月

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